Дослідження взаємодії цинку (ІІ) з макромолекулярними компонентами склоподібного тіла методами УФ-спектроскопії та динамічного розсіювання світла

Abstract

Одним із завдань під час створення лікарського засобу, що містить гідрогель склоподібного тіла (СТ), нанорозмірний кремнезем та сполуку цинку, є дослідження закономірностей комплексоутворення гіалуронової кислоти та білка – основних макромолекулярних компонентів СТ – з йонами цинку. Нами виявлено, що при змішуванні розчинів СТ і сульфату цинку спостерігається ріст оптичної густини в УФ діапазоні спектра, ймовірно за рахунок розсіювання світла в результаті збільшення числа макромолекулярних агрегатів. Доведено, що цей ефект не є наслідком утворення нерозчинних сполук через зміну рН середовища і, таким чином, може бути пояснений взаємодією (комплексоутворенням) компонентів СТ з йонами цинку. З метою встановлення закономірностей комплексоутворення проводили спектрофотометричне титрування СТ і окремо розчинів очищеного гіалуронату натрію та модельного білка – бичачого сироваткового альбуміну (БСА) – йонами цинку. До сталої кількості СТ, розведеного водою 1:5, додавали зростаючі кількості розчину сульфату цинку, після чого реєстрували УФ-спектр. Як виявилось, після додавання сульфату цинку в діапазоні концентрацій 2.5–5.0 мас. % приріст оптичної густини майже одразу стає максимальним і не залежить від кількості титранту, що можна пояснити насиченням усіх активних центрів СТ, до яких належать карбоксильні групи гіалуронової кислоти та електронодонoрні групи білка: NH2-групи, амідний зв’язок, тіогрупи тощо. В діапазоні 0–0.5 мас. % сульфату цинку (0–17.5 ммоль/л Zn2+) спостерігається поступове збільшення оптичної густини, що дозволило розрахувати параметри рівноваги в системі СТ + n Zn2+ ↔ СТ • (Zn2+)n. Для БСА, який також демонстрував поступове збільшення оптичної густини в УФ діапазоні, з метою визначення стехіометрії комплексу БСА • (Zn2+)n був використаний метод молярних відношень, при цьому встановлено, що на одну молекулу БСА припадає близько 800 йонів цинку. У разі очищеного гіалуронату натрію метод спектрофотометричного титрування виявився непридатним або комплексоутворення взагалі не відбувалось. Отже, взаємодія СТ із йонами цинку здійснюється переважно за рахунок білкового компонента, а не гіалуронану. Розмірні характеристики агрегатів, що утворюються внаслідок взаємодії СТ і БСА з йонами цинку, досліджено методом динамічного розсіювання світла (ДРС). One of the tasks for creating of a medicinal product which contains hydrogel of vitreous humor (VH), nanosized silica and zinc compound is studying of the regularities of complex formation of hyaluronic acid and protein, as a main macromolecular components of VH, with zinc ions. We have found that after mixing solutions of VH and zinc sulfate the growth of optical density in UV range of the spectrum is observed, apparently due to light scattering as a result of increasing quantity of macromolecular aggregates. It has been proved that this effect is not a consequence of the formation of insoluble compounds due to changes in pH of the medium and thus can be explained by the interaction (complexation) of VH components with zinc ions. In order to determine the regularities of complex formation, the spectrophotometric titration of VH and separately solutions of purified sodium hyaluronate and model protein – bovine serum albumin (BSA) – with zinc ions was carried out. To constant amount of VH (dilution 1:5) increasing amounts of zinc sulfate solution were added, after that UV spectrum was recorded. As it turned out, after addition of zinc sulfate in the concentrations range 2.5–5.0 mass. % the growth of optical density almost immediately becomes maximal and does not depend on the amount of titrant, which can be explained by saturation of all active centers of VH, which include carboxyl groups of hyaluronic acid and electron donor groups of protein: NH2-groups, amide bond, thiogroups, etc. In the range 0–0.5 mass. % of zinc sulfate (0–17.5 mmol/l of Zn2+) there is a gradual increase in optical density, which makes it possible to calculate equilibrium parameters in the system VH + n Zn2+ ↔ VH • (Zn2+)n. For BSA which also demonstrated a gradual increase of optical density in UV range, in order to determine the stoichiometry of BSA • (Zn2+)n complex the method of molar ratios was used, and it was found that there were about 800 ions of Zn2+ per one BSA molecule. In the case of purified sodium hyaluronate, the method of spectrophotometric titration proved to be unsuitable or complexation does not occur at all. Consequently, the interaction of VH with zinc ions is carried out mainly due to the protein component rather than hyaluronan. Dimensional characteristics of aggregates formed as a result of the interaction between VH or BSA and zinc ions were investigated by the method of dynamic light scattering (DLS).